Anne-Florence Marbot wurde in Bern geboren. Nach der Ausbildung zur Primarlehrerin studierte sie an der Hochschule der Künste Bern und der Staatlichen Musikhochschule Freiburg im Breisgau Gesang. Sie beendete ihre Ausbildung am Schweizer Opernstudio mit Auszeichnung.

Von 2002 bis 2006 war sie Ensemblemitglied am Theater Biel-Solothurn, wo sie sich ein breites Repertoire erarbeiten konnte. So war sie u. a. als Zerlina in «Don Giovanni», als Susanna in «Le nozze di Figaro», als Olympia in «Hoffmanns Erzählungen» und als Giulietta in «I Capuleti ed i Montecchi» zu erleben.

2006 debütierte sie am Stadttheater Bern als Magnolia in «Showboat». Seither ist sie dort festes Ensemblemitglied. Zu ihren Partien in Bern gehören u. a. Adele in «Die Fledermaus», Eliza in «My Fair Lady«, Adina in «L´elisir d´amore» und Soeur Constance in «Les Dialogues des Carmélites.» Für ihre Interpretation der Helena in Brittens «A Midsummer Night´s Dream» wurde sie 2009 als Nachwuchskünstlerin der Opernwelt nominiert.

Neben ihrer Tätigkeit in Bern ist sie als Konzert- und Liedsängerin zu hören. Zudem ist sie ein regelmässiger Gast an Schweizer Sommerfestivals wie den Murten Classics, den Solothurner Classics und der Openair Oper Schloss Hallwyl.

Anne-Florence Marbot ist mehrfache Preisträgerin von Stiftungen und Wettbewerben, wie zum Beispiel dem Migros-Stipendienwettbewerb oder der Kiefer-Hablitzl-Stiftung.